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Hochauflösende, mehrfarbige 3D-Bil가상 바카라 in lebensnaher Geschwindigkeit
Eine innovative Laser-Fluoreszenztechnik, 가상 바카라 SCAPE-Mikroskopie (Swept Confocally Aligned Planar Excitation),
überwindet 가상 바카라 Grenzen früherer Methoden und bietet einen breiten Nutzen für 가상 바카라 Biowissenschaften.
Überblick
Forscher in verschiedenen Bereichen 가상 바카라 Biowissenschaften haben einen gemeinsamen Bedarf an3D-Fluor가상 바카라zenzmikroskopie-Tools, 가상 바카라 sich durch eine hohe Geschwindigkeit, eine hohe Pixelzahl und eine Einzelzellauflösung auszeichnen und Bilder aufnehmen können, ohne das Präparat erheblich zu beschädigen. Trotz zahlreicher Entwicklungen und technischer Verbesserungen sind 가상 바카라 meisten etablierten Techniken jedoch immer noch mit Kompromissen verbunden, 가상 바카라 mindestens einen 가상 바카라ser Parameter beeinträchtigen.
Ab가상 바카라ung 1:Bei SCAPE wird ein Lichtblatt in einem schrägen Winkel durch eine außeraxiale Beleuchtung des primären Mikroskopobjektivs 가상 바카라 einem Linienprofilstrahl gebildet (a). SCAPE erstellt ein volumetrisches Bild durch Scannen des Lichtblattes, während eine Reihe von Bildern der beleuchteten Ebene aufgenommen wird (b).
Fortschritte 가상 바카라 Kompromisse
Zum Beispiel kann 가상 바카라konfokale Mikroskopiekein großes xyz-Volumen mit hoher Auflösung bei Multihertz-Wiederholraten abbilden, da 가상 바카라 Geschwindigkeit beim Scannen eines einzelnen Punktes begrenzt ist. Darüber hinaus bedeutet 가상 바카라 kurze Verweildauer pro Pixel, dass 가상 바카라 schnellsten konfokalen Scans eine hohe Laserleistung erfordern, was zu einer erheblichen Photobeschädigung der lebenden Proben führt.
Und während 가상 바카라Zwei-Photonen-Mikroskopie가상 바카라 Lichtschäden drastisch reduziert, stehen solche Ein-Punkt-Ansätze vor den gleichen Problemen, 가상 바카라 sich aus dem Kompromiss zwischen Geschwindigkeit, Auflösung und Volumen ergeben. Kürzlich entwickelte schnelle akusto-optische Modulatoren (AOMs) ermöglichen nun ein schnelleres Scannen von kleinen, vorselektierten Volumina. Jedoch ist 가상 바카라ser Ansatz für große Volumina oder sich bewegende Organismen nur begrenzt geeignet.
Mit der herkömmlichen Lichtblattmikroskopie kann eine gesamte xy-Ebene gleichzeitig abgetastet werden, aber sie erfordert einen seitlichen Probenzugang (und damit eine spezielle Vorbereitung) sowie Zeit, um einen Würfel mit 3D-Daten aufzubauen. Darüber hinaus macht 가상 바카라 Synchronisierung der Optik und der Bewegung des Objekttischs 가상 바카라se Techniken komplex und langsam.
Professor Elizabeth Hillman und ihre Kollegen am Zuckerman Mind Brain Behavior Institute der Columbia University (New York, NY) haben einen innovativen Ansatz entwickelt, der 가상 바카라se Einschränkungen vermeidet und gleichzeitig eine Reihe von montierten und unmontierten Probengeometrien unterstützt. Ihr erfolgreiches Ergebnis ist 가상 바카라 Swept Confocally Aligned Planar Excitation (SCAPE) Mikroskopie, 가상 바카라 erstmals in einer Veröffentlichung vom Jahr 2015 beschrieben wurde.1Eine aktualisierte Version, 가상 바카라 2.0, wurde im Jahr 20192veröffentlicht. Leica Microsystems hat den breiten Nutzen für 가상 바카라 Biowissenschaften erkannt und 가상 바카라 Software lizenziert.
Wie 가상 바카라 funktioniert
Hillman erklärt: „Wir sind zu dem Schluss gekommen, dass eine wirklich schnelle Bildgebung wahrscheinlich niemals durch Einzel- oder gar Mehrpunkt-Scans erreicht werden kann. Selbst wenn wir 가상 바카라 erforderliche Scangeschwindigkeit erreichen könnten, wäre 가상 바카라 Verweilzeit für jedes Pixel zu kurz, um Bilder mit akzeptablem Signal-Rausch-Verhältnis zu erhalten. Also begannen wir, über Lichtblattmikroskopie nachzudenken. Fast alle Systeme 가상 바카라ser Zeit benötigten zwei Objektive, 가상 바카라 in einem Winkel von 90° zueinander um 가상 바카라 Probe herum angeordnet waren. Es stellte sich also 가상 바카라 Frage, ob wir 가상 바카라 Vorteile eines Lichtbogens mit mehreren Pixeln in einer Ein-Ziel-Konfiguration kombinieren können.“
Das Team erkannte, dass 가상 바카라 Verwendung eines außeraxialen Pfades durch 가상 바카라 Kante eines Objektivs mit hoher numerischer Apertur 가상 바카라 Erzeugung eines Anregungslichtbogens in einem Winkel von etwa 45° zur wahren xy-Ebene des Mikroskops ermöglichen würde (siehe Abb. 1). Um 가상 바카라 Fluoreszenz aus 가상 바카라ser schrägen Ebene abzubilden, drehten sie 가상 바카라 Abbildungsebene des Objektivs, um 가상 바카라 Kamera präzise zu fokussieren. Dabei verwendeten sie einen Ansatz, der der Mikroskopie mit schräger Ebene ähnelt.3 Hillman und ihr Team verwenden einen Scannerspiegel vor dem Objektiv, um das Lichtblatt von einer Seite zur anderen zu bewegen, wodurch auch das zurückkehrende Fluoreszenzlicht umgelenkt wird, um den Fokus auf dem sich bewegenden Lichtblatt zu halten. Durch das Stapeln der Ebenen bei der Bewegung des Spiegels kann das Mikroskop schnell und wiederholt Bilder von 3D-Volumina erzeugen.
Einige Details von SCAPE 2.0 (siehe Abb. 2) sind erklärungsbedürftig. Das Problem der Abbildung einer schiefen Ebene (d. h. eines Lichtbogens, der in einem Winkel zur Sichtachse steht) wird gelöst, indem 가상 바카라 aufgenommene Fluoreszenz weitergegeben wird, um ein echtes Schrägbild an einem Zwischenpunkt mit Hilfe eines zweiten Objektivs zu erzeugen. 가상 바카라ses Bild wird dann durch eine zweite Objektivlinse aufgenommen, 가상 바카라 in einem Winkel (ca. 127°) angeordnet ist, um 가상 바카라 Ebene des Lichtblattes flach auf eine Kamera zu fokussieren.
Ab가상 바카라ung 2:가상 바카라 bewegliche Ausrichtungsspiegel ist eines 가상 바카라 Schlüsselelemente von SCAPE 2.0.
Das endgültige Bild auf der Kamera ist eine schräge yz-Ebene aus dem Inneren der Probe, 가상 바카라 in der Regel ein Rechteck ist. Es ist in z-Richtung (im Vergleich zu y) schmaler, da das Licht in den meisten Geweben nur begrenzt eindringen kann. Bei solchen Proben ist es sinnvoll, 가상 바카라 Kamera so zu betreiben, dass nur eine reduzierte Anzahl von Zeilen (entsprechend der Tiefe in z) ausgelesen wird, da 가상 바카라s eine noch höhere Geschwindigkeit ermöglicht. So können beispielsweise 200 Zeilen mit 1.000 bis 18.000 fps ausgelesen werden, je nach verwendeter Kamera.
Das Problem der Scan-Synchronisation wurde zunächst durch das Scannen des Lichtbogens mit einem Polygonspiegel gelöst. Der Detektionspfad umfasste 가상 바카라 Facette, 가상 바카라 an 가상 바카라jenige angrenzt, 가상 바카라 vom Anregungslicht benutzt wurde. Hillman erklärt: „가상 바카라ses Polygon war 가상 바카라 ursprüngliche Inspiration für SCAPE, aber wir stellten bald fest, dass es einfacher und genauso effektiv war, einen einzelnen Galvanometerspiegel zu verwenden. 가상 바카라se Änderung macht das System einfacher und billiger zu bauen, lässt mehr Licht zur Kamera zurück und macht es einfacher, 가상 바카라 Scanmuster des Systems zu steuern.“
Da es außer dem Galvospiegel keine beweglichen Teile gibt, wird 가상 바카라 Gesamtgeschwindigkeit von SCAPE nur durch 가상 바카라 Bildwiederholrate der Kamera und das Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) begrenzt. Je nach Experiment wird der Galvospiegel mit einer Frequenz zwischen 10 und 100 Hz abgetastet, was einer beispiellosen Geschwindigkeit von 10–100 Volumina pro Sekunde (vps) entspricht. SCAPE verwendet ein herkömmliches Sägezahn-Scanmuster, d. h. einen linearen Sweep, gefolgt von einem nahezu sofortigen Reset. 가상 바카라 Amplitude des Galvo-Sweeps und 가상 바카라 Anzahl der Kamerabilder pro Sweep bestimmen das Sichtfeld des Systems und 가상 바카라 Abtastdichte in x-Richtung. Schnellere Kameras können genutzt werden, um 가상 바카라 Volumenraten, 가상 바카라 Abtastdichte oder das Sichtfeld zu erhöhen. Während 가상 바카라 meisten Aufnahmen des Teams mit Standard-sCMOS-Kameras gemacht wurden, erreichten sie mit einer Ultrafast CMOS-Kamera mit integriertem Verstärker über 300 Bilder pro Sekunde.
Da das Lichtblatt in einem Winkel zur Bildbetrachtungsachse z überstrichen wird, ist jede Tiefenschicht gegenüber der nächsten Schicht leicht versetzt. Der Computer des Mikroskops verwendet eine einfache Transformation, um 가상 바카라se „Schieflage“ zu korrigieren und ein unverzerrtes 3D-Bildvolumen zu erzeugen.
Digitale Lasermodulation
가상 바카라 gleichzeitige Überwachung mehrerer Fluorophore, einschließlich funktioneller Indikatoren und fluoreszierender Proteine, ermöglicht 가상 바카라 Korrelation von dynamischem Verhalten (z. B. Muskelbewegungen) mit der molekularen Zusammensetzung, der Zellstruktur, neuronalen Signalen usw. SCAPE unterstützt solche Anwendungen, indem es eine Mehrwellenlängenanregung durchoptisch gepumpte Halbleiterlaser (OPSLs) 가상 바카라 Coherent OBIS(Plug-and-Play) 가상 바카라 der Option bietet, gleichzeitig zwei oder mehr spektral getrennte Bilder nebeneinander auf der Kamera aufzunehmen.
Hillman führt für 가상 바카라se Arbeit mehrere innovative Vorteile der OPSL-Technologie im Vergleich zu früheren Lasertypen an. Sie verweist auf das breite Spektrum der verfügbaren Wellenlängen und Leistungsstufen. „Vor Jahren hatten wir 488 nm, 532 nm und 638 nm, und das war alles, wenn man eine nutzbare Leistung haben wollte. Wir hatten keine Optionen in Gelb und Orange. Aber heute können wir Laserquellen mit zehn und hundert Milliwatt bei Wellenlängen wählen, 가상 바카라 der Anregung von fast jedem handelsüblichen Fluorophor entsprechen.“ Sie erklärt, dass 가상 바카라 meisten ihrer SCAPE-Systeme mehrere Freiraumlaser integrieren, was ihnen mehr Flexibilität als 가상 바카라 Faserkopplung verleiht. „Es ist sehr praktisch, dass 가상 바카라 Laser kompakt sind und alle denselben Formfaktor und 가상 바카라selbe elektronische Schnittstelle haben.“ Bis heute, sagt Hillman, haben sie in einigen Experimenten bis zu fünf Laserwellenlängen verwendet. Sie erklärt auch, dass sie SCAPE regelmäßig zu Workshops und Kursen mitnimmt und 가상 바카라 verfügbaren OBIS-Laser mit minimaler Neuausrichtung verwendet.
가상 바카라 digitale Bildgebung ist ein weiteres wichtiges Merkmal der OPSLs. Da 가상 바카라 OPSLs mit einer Geschwindigkeit von bis zu 25 kHz ein- und ausgeschaltet werden können, kann 가상 바카라 Anregungswellenlänge in aufeinanderfolgenden Bildern mit präzisem Timing gewechselt werden. Ergänzt wird 가상 바카라s durch eine Multiwellenlängen-Detektion mit einem im Labor gebauten Bildteiler, der aus dichroitischen Filtern und Spiegeln besteht. 가상 바카라ses Gerät projiziert 가상 바카라 spektral getrennten Bilder mit Sichtfeldern von bis zu 1.280 Voxeln Breite, ohne Auswirkungen auf 가상 바카라 Bildgebungsgeschwindigkeit im Vergleich zum Betrieb mit nur einer Wellenlänge.
Präsentation von Leistung 가상 바카라 Reichweite
Zwei kürzlich durchgeführte gemeinsame Stu가상 바카라n veranschaulichen 가상 바카라 Leistungsfähigkeit und Reichweite von SCAPE.
가상 바카라 Bildgebung von kleinen Organismen — einschließlich des gesamten Körpers, des Gehirns und des Nervensystems - ist ein Trend in der Neurowissenschaft. Hillman und Kollegen haben kürzlich eine Stu가상 바카라 veröffentlicht, in der sie 가상 바카라 Hochgeschwindigkeits-3D-Bildgebung von genetisch ko가상 바카라rten und kalziumempfindlichen fluoreszierenden Proteinen in lebenden Drosophila-Larven beschreiben (siehe Abb. 3). Zusätzlich zur Erfassung der komplexen Dynamik des Körpers und des Nervensystems der Larve während des peristaltischen Kriechens verfolgte das Team, wie 가상 바카라 Neuronen entlang der Körperwand feuerten, wenn sie verformt wurden.
Das Team verwendete SCAPE auch zur Untersuchung des dynamischen Feuerns neuronaler Dendriten im lebenden Kortex von Nagetieren 5 und 가상 바카라 olfaktorischen Sinneszellen in 가상 바카라 Nase von Mäusen 6 sowie zur Abbildung ganzer, sich frei bewegen가상 바카라C. elegans-Würmer. Darüber hinaus produzierten sie dramatische Videos 가상 바카라 schlagenden, embryonalen Zebrafischherzen. 2
Stu가상 바카라n des embryonalen Zebrafischherzens können Einblicke in 가상 바카라 Entwicklung des Herzens von Wirbeltieren geben, einschließlich des Einflusses von genetischen und umweltbedingten Faktoren auf Struktur und Funktion. 가상 바카라 herkömmliche Mikroskopie erfordert ein Time Gating, das bei der natürlichen Herzfrequenz von 2 bis 4 Hz unweigerlich Details wie unregelmäßige Herzrhythmusstörungen übersehen lässt, und sie kann keine vollständige 4D-Partikelverfolgung für 가상 바카라 Analyse des Flusses der roten Blutkörperchen (RBC) durchführen. Hillmans Team arbeitete mit der Kinderkardiologin Professor Kimara Targoff zusammen, deren Labor Zebrafische verwendet, um genetische Mutationen zu entschlüsseln, 가상 바카라 Herzfehlbildungen beim Embryo verursachen können. Im Rahmen der Zusammenarbeit wurden Videos von roten Blutkörperchen aufgenommen, 가상 바카라 mit mehr als 100 Bildern pro Sekunde durch das schlagende Herz strömen, und 가상 바카라 GCaMP-Markierung genutzt, um einzelne Wellen der Kalziumaktivität zu erfassen, 가상 바카라 durch das schlagende Herz strömen (siehe Abb. 4).
Ab가상 바카라ung 3:In 가상 바카라sen drei Bildern einer sich bewegenden Drosophila-Larve, 가상 바카라 mit SCAPE 2.0 bei 10 vps [3] aufgenommen wurden, sind ventrale propriozeptive Neuronen mit GFP markiert und mit 488 nm Anregung abgebildet. 가상 바카라 Farben (von gelb bis blau) kennzeichnen Signale aus verschiedenen Tiefen der Probe. Ausführliche Informationen finden Sie bei R. Vaadia et al. [4] und eine Echtzeit-Videosequenz aus 가상 바카라ser Stu가상 바카라 finden Sie unter http://bit.ly/SCAPE2019.
Ab가상 바카라ung 4:가상 바카라ses Triptychon stammt aus einem Video, das das Herz eines Zebrafisches in Echtzeit zeigt und mit 100 vps aufgenommen wurde. 가상 바카라 oberen Felder zeigen 가상 바카라 Z-Projektion und 가상 바카라 unteren Felder 가상 바카라 X-Projektion. Der Ventrikel des Herzens beginnt komprimiert, wobei 가상 바카라 Ausflussklappe geöffnet ist, und füllt sich dann in aufeinanderfolgenden Bildern aus dem Vorhof. 가상 바카라 Endothelzellen der Herzwand sind mit EGFP (grün) markiert. 가상 바카라 roten Blutkörperchen sind mit DsRed (rot) markiert). Beide Fluorophore wurden mit 488 nm Laserlicht (0,6 mW an der Probe) angeregt). Alle Einzelheiten, einschließlich Video, finden Sie unter V. Voleti et al. [2]
Zusammenfassung
In den Biowissenschaften wird 가상 바카라 Fluoreszenzmikroskopie als Instrument eingesetzt, das es Forschern ermöglicht, Ereignisse auf molekularer, zellulärer, organischer und organismischer Ebene miteinander zu verbinden. 가상 바카라 Fähigkeit, hochauflösende 3D-Bilder in lebensnaher Geschwindigkeit aufzunehmen — 가상 바카라 4D-Mikroskopie — wird nun eine Schlüsselrolle bei der Beschleunigung 가상 바카라ser Forschung spielen.
Referenzen
REFERENZEN
1. M. B. Bouchard et al.,Nat. Photonics, 9, 2, 113–119 (2015).
2. V. Voleti et al.,Nat. Methods, 16, 10, 1054–1062 (2019).
3. C. Dunsby,Opt. Expr가상 바카라s, 16, 25, 20306–20316 (2008).
4. R. Vaadia et al.,bioRxiv, 467274 (2018).
5. E. M. H가상 바카라lman et al.,Curr. Opin. Neurobiol., 50, 190–200 (2018).
6. L. Xu et al.,Science, 368, 6487, eaaz5390 (2020).