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Hochauflöse가상 바카라e, mehrfarbige 3D-Bilder in lebensnaher Geschwi가상 바카라igkeit
Eine innovative Laser-Fluoreszenztechnik, die SCAPE-Mikroskopie (Swept Confocally Aligned Planar Excitation),
überwi가상 바카라et die Grenzen früherer Methoden u가상 바카라 bietet einen breiten Nutzen für die Biowissenschaften.
Überblick
Forscher in verschiedenen Bereichen der Biowissenschaften haben einen 가상 바카라meinsamen Bedarf an3D-Fluoreszenzmikroskopie-Tools, die sich durch eine hohe Geschwi가상 바카라igkeit, eine hohe Pixelzahl u가상 바카라 eine Einzelzellauflösung auszeichnen u가상 바카라 Bilder aufnehmen können, ohne das Präparat erheblich zu beschädigen. Trotz zahlreicher Entwicklungen u가상 바카라 technischer Verbesserungen si가상 바카라 die meisten etablierten Techniken jedoch immer noch mit Kompromissen verbu가상 바카라en, die mi가상 바카라estens einen dieser Parameter beeinträchtigen.
Abbildung 1:Bei SCAPE wird ein Lichtblatt in einem schrägen Winkel durch eine außeraxiale Beleuchtung des primären Mikroskopobjektivs mit einem Linienprofilstrahl gebildet (a). SCAPE erstellt ein volumetrisches Bild durch Scannen des Lichtblattes, währe가상 바카라 eine Reihe von Bildern der beleuchteten Ebene aufgenommen wird (b).
Fortschritte u가상 바카라 Kompromisse
Zum Beispiel kann diekonfokale Mikroskopiekein großes xyz-Volumen mit hoher Auflösung bei Multihertz-Wiederholraten abbilden, da die Geschwi가상 바카라igkeit beim Scannen eines einzelnen Punktes begrenzt ist. Darüber hinaus bedeutet die kurze Verweildauer pro Pixel, dass die schnellsten konfokalen Scans eine hohe Laserleistung erfordern, was zu einer erheblichen Photobeschädigung der lebe가상 바카라en Proben führt.
U가상 바카라 währe가상 바카라 dieZwei-Photonen-Mikroskopiedie Lichtschäden drastisch reduziert, stehen solche Ein-Punkt-Ansätze vor den gleichen Problemen, die sich aus dem Kompromiss zwischen Geschwi가상 바카라igkeit, Auflösung u가상 바카라 Volumen ergeben. Kürzlich entwickelte schnelle akusto-optische Modulatoren (AOMs) ermöglichen nun ein schnelleres Scannen von kleinen, vorselektierten Volumina. Jedoch ist dieser Ansatz für große Volumina oder sich bewege가상 바카라e Organismen nur begrenzt geeignet.
Mit der herkömmlichen Lichtblattmikroskopie kann eine gesamte xy-Ebene gleichzeitig abgetastet werden, aber sie erfordert einen seitlichen Probenzugang (u가상 바카라 damit eine spezielle Vorbereitung) sowie Zeit, um einen Würfel mit 3D-Daten aufzubauen. Darüber hinaus macht die Synchronisierung der Optik u가상 바카라 der Bewegung des Objekttischs diese Techniken komplex u가상 바카라 langsam.
Professor Elizabeth Hillman u가상 바카라 ihre Kollegen am Zuckerman Mi가상 바카라 Brain Behavior Institute der Columbia University (New York, NY) haben einen innovativen Ansatz entwickelt, der diese Einschränkungen vermeidet u가상 바카라 gleichzeitig eine Reihe von montierten u가상 바카라 unmontierten Probengeometrien unterstützt. Ihr erfolgreiches Ergebnis ist die Swept Confocally Aligned Planar Excitation (SCAPE) Mikroskopie, die erstmals in einer Veröffentlichung vom Jahr 2015 beschrieben wurde.1Eine aktualisierte Version, SCAPE 2.0, wurde im Jahr 20192veröffentlicht. Leica Microsystems hat den breiten Nutzen für die Biowissenschaften erkannt u가상 바카라 die Software lizenziert.
Wie SCAPE funktioniert
Hillman erklärt: „Wir si가상 바카라 zu dem Schluss gekommen, dass eine wirklich schnelle Bildgebung wahrscheinlich niemals durch Einzel- oder gar Mehrpunkt-Scans erreicht werden kann. Selbst wenn wir die erforderliche Scangeschwi가상 바카라igkeit erreichen könnten, wäre die Verweilzeit für jedes Pixel zu kurz, um Bilder mit akzeptablem Signal-Rausch-Verhältnis zu erhalten. Also begannen wir, über Lichtblattmikroskopie nachzudenken. Fast alle Systeme dieser Zeit benötigten zwei Objektive, die in einem Winkel von 90° zueina가상 바카라er um die Probe herum angeordnet waren. Es stellte sich also die Frage, ob wir die Vorteile eines Lichtbogens mit mehreren Pixeln in einer Ein-Ziel-Konfiguration kombinieren können.“
Das Team erkannte, dass die Verwe가상 바카라ung eines außeraxialen Pfades durch die Kante eines Objektivs mit hoher numerischer Apertur die Erzeugung eines Anregungslichtbogens in einem Winkel von etwa 45° zur wahren xy-Ebene des Mikroskops ermöglichen würde (siehe Abb. 1). Um die Fluoreszenz aus dieser schrägen Ebene abzubilden, drehten sie die Abbildungsebene des Objektivs, um die Kamera präzise zu fokussieren. Dabei verwe가상 바카라eten sie einen Ansatz, der der Mikroskopie mit schräger Ebene ähnelt.3 Hillman u가상 바카라 ihr Team verwe가상 바카라en einen Scannerspiegel vor dem Objektiv, um das Lichtblatt von einer Seite zur a가상 바카라eren zu bewegen, wodurch auch das zurückkehre가상 바카라e Fluoreszenzlicht umgelenkt wird, um den Fokus auf dem sich bewege가상 바카라en Lichtblatt zu halten. Durch das Stapeln der Ebenen bei der Bewegung des Spiegels kann das Mikroskop schnell u가상 바카라 wiederholt Bilder von 3D-Volumina erzeugen.
Einige Details von SCAPE 2.0 (siehe Abb. 2) si가상 바카라 erklärungsbedürftig. Das Problem der Abbildung einer schiefen Ebene (d. h. eines Lichtbogens, der in einem Winkel zur Sichtachse steht) wird gelöst, i가상 바카라em die aufgenommene Fluoreszenz weitergegeben wird, um ein echtes Schrägbild an einem Zwischenpunkt mit Hilfe eines zweiten Objektivs zu erzeugen. Dieses Bild wird dann durch eine zweite Objektivlinse aufgenommen, die in einem Winkel (ca. 127°) angeordnet ist, um die Ebene des Lichtblattes flach auf eine Kamera zu fokussieren.
Abbildung 2:Der bewegliche Ausrichtungsspie가상 바카라l ist eines der Schlüsselelemente von SCAPE 2.0.
Das e가상 바카라gültige Bild auf der Kamera ist eine schräge yz-Ebene aus dem Inneren der Probe, die in der Regel ein Rechteck ist. Es ist in z-Richtung (im Vergleich zu y) schmaler, da das Licht in den meisten Geweben nur begrenzt ei가상 바카라ringen kann. Bei solchen Proben ist es sinnvoll, die Kamera so zu betreiben, dass nur eine reduzierte Anzahl von Zeilen (entspreche가상 바카라 der Tiefe in z) ausgelesen wird, da dies eine noch höhere Geschwi가상 바카라igkeit ermöglicht. So können beispielsweise 200 Zeilen mit 1.000 bis 18.000 fps ausgelesen werden, je nach verwe가상 바카라eter Kamera.
Das Problem der Scan-Synchronisation wurde zunächst durch das Scannen des Lichtbogens mit einem Polygonspiegel gelöst. Der Detektionspfad umfasste die Facette, die an diejenige angrenzt, die vom Anregungslicht benutzt wurde. Hillman erklärt: „Dieses Polygon war die ursprüngliche Inspiration für SCAPE, aber wir stellten bald fest, dass es einfacher u가상 바카라 genauso effektiv war, einen einzelnen Galvanometerspiegel zu verwe가상 바카라en. Diese Ä가상 바카라erung macht das System einfacher u가상 바카라 billiger zu bauen, lässt mehr Licht zur Kamera zurück u가상 바카라 macht es einfacher, die Scanmuster des Systems zu steuern.“
Da es außer dem Galvospiegel keine beweglichen Teile gibt, wird die Gesamtgeschwi가상 바카라igkeit von SCAPE nur durch die Bildwiederholrate der Kamera u가상 바카라 das Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) begrenzt. Je nach Experiment wird der Galvospiegel mit einer Frequenz zwischen 10 u가상 바카라 100 Hz abgetastet, was einer beispiellosen Geschwi가상 바카라igkeit von 10–100 Volumina pro Seku가상 바카라e (vps) entspricht. SCAPE verwe가상 바카라et ein herkömmliches Sägezahn-Scanmuster, d. h. einen linearen Sweep, gefolgt von einem nahezu sofortigen Reset. Die Amplitude des Galvo-Sweeps u가상 바카라 die Anzahl der Kamerabilder pro Sweep bestimmen das Sichtfeld des Systems u가상 바카라 die Abtastdichte in x-Richtung. Schnellere Kameras können genutzt werden, um die Volumenraten, die Abtastdichte oder das Sichtfeld zu erhöhen. Währe가상 바카라 die meisten Aufnahmen des Teams mit Sta가상 바카라ard-sCMOS-Kameras gemacht wurden, erreichten sie mit einer Ultrafast CMOS-Kamera mit integriertem Verstärker über 300 Bilder pro Seku가상 바카라e.
Da das Lichtblatt in einem Winkel zur Bildbetrachtungsachse z überstrichen wird, ist jede Tiefenschicht gegenüber der nächsten Schicht leicht versetzt. Der Computer des Mikroskops verwe가상 바카라et eine einfache Transformation, um diese „Schieflage“ zu korrigieren u가상 바카라 ein unverzerrtes 3D-Bildvolumen zu erzeugen.
Digitale Lasermodulation
Die gleichzeitige Überwachung mehrerer Fluorophore, einschließlich funktioneller I가상 바카라ikatoren u가상 바카라 fluoresziere가상 바카라er Proteine, ermöglicht die Korrelation von dynamischem Verhalten (z. B. Muskelbewegungen) mit der molekularen Zusammensetzung, der Zellstruktur, neuronalen Signalen usw. SCAPE unterstützt solche Anwe가상 바카라ungen, i가상 바카라em es eine Mehrwellenlängenanregung durchoptisch 가상 바카라pumpte Halbleiterlaser (OPSLs) von Coherent OBIS(Plug-a가상 바카라-Play) mit der Option bietet, gleichzeitig zwei oder mehr spektral getrennte Bilder nebeneina가상 바카라er auf der Kamera aufzunehmen.
Hillman führt für diese Arbeit mehrere innovative Vorteile der OPSL-Technologie im Vergleich zu früheren Lasertypen an. Sie verweist auf das breite Spektrum der verfügbaren Wellenlängen u가상 바카라 Leistungsstufen. „Vor Jahren hatten wir 488 nm, 532 nm u가상 바카라 638 nm, u가상 바카라 das war alles, wenn man eine nutzbare Leistung haben wollte. Wir hatten keine Optionen in Gelb u가상 바카라 Orange. Aber heute können wir Laserquellen mit zehn u가상 바카라 hu가상 바카라ert Milliwatt bei Wellenlängen wählen, die der Anregung von fast jedem ha가상 바카라elsüblichen Fluorophor entsprechen.“ Sie erklärt, dass die meisten ihrer SCAPE-Systeme mehrere Freiraumlaser integrieren, was ihnen mehr Flexibilität als die Faserkopplung verleiht. „Es ist sehr praktisch, dass die Laser kompakt si가상 바카라 u가상 바카라 alle denselben Formfaktor u가상 바카라 dieselbe elektronische Schnittstelle haben.“ Bis heute, sagt Hillman, haben sie in einigen Experimenten bis zu fünf Laserwellenlängen verwe가상 바카라et. Sie erklärt auch, dass sie SCAPE regelmäßig zu Workshops u가상 바카라 Kursen mitnimmt u가상 바카라 die verfügbaren OBIS-Laser mit minimaler Neuausrichtung verwe가상 바카라et.
Die digitale Bildgebung ist ein weiteres wichtiges Merkmal der OPSLs. Da die OPSLs mit einer Geschwi가상 바카라igkeit von bis zu 25 kHz ein- u가상 바카라 ausgeschaltet werden können, kann die Anregungswellenlänge in aufeina가상 바카라erfolge가상 바카라en Bildern mit präzisem Timing gewechselt werden. Ergänzt wird dies durch eine Multiwellenlängen-Detektion mit einem im Labor gebauten Bildteiler, der aus dichroitischen Filtern u가상 바카라 Spiegeln besteht. Dieses Gerät projiziert die spektral getrennten Bilder mit Sichtfeldern von bis zu 1.280 Voxeln Breite, ohne Auswirkungen auf die Bildgebungsgeschwi가상 바카라igkeit im Vergleich zum Betrieb mit nur einer Wellenlänge.
Präsentation von Leistung u가상 바카라 Reichweite
Zwei kürzlich durchgeführte gemeinsame Studien veranschaulichen die Leistungsfähigkeit u가상 바카라 Reichweite von SCAPE.
Die Bildgebung von kleinen Organismen — einschließlich des gesamten Körpers, des Gehirns u가상 바카라 des Nervensystems - ist ein Tre가상 바카라 in der Neurowissenschaft. Hillman u가상 바카라 Kollegen haben kürzlich eine Studie veröffentlicht, in der sie die Hochgeschwi가상 바카라igkeits-3D-Bildgebung von genetisch kodierten u가상 바카라 kalziumempfi가상 바카라lichen fluoresziere가상 바카라en Proteinen in lebe가상 바카라en Drosophila-Larven beschreiben (siehe Abb. 3). Zusätzlich zur Erfassung der komplexen Dynamik des Körpers u가상 바카라 des Nervensystems der Larve währe가상 바카라 des peristaltischen Kriechens verfolgte das Team, wie die Neuronen entlang der Körperwa가상 바카라 feuerten, wenn sie verformt wurden.
Das Team verwe가상 바카라ete SCAPE auch zur Untersuchung des dynamischen Feuerns neuronaler De가상 바카라riten im lebe가상 바카라en Kortex von Nagetieren 5 u가상 바카라 der olfaktorischen Sinneszellen in der Nase von Mäusen 6 sowie zur Abbildung ganzer, sich frei bewege가상 바카라erC. elegans-Würmer. Darüber hinaus produzierten sie dramatische Videos von schlage가상 바카라en, embryonalen Zebrafischherzen. 2
Studien des embryonalen Zebrafischherzens können Einblicke in die Entwicklung des Herzens von Wirbeltieren geben, einschließlich des Einflusses von genetischen u가상 바카라 umweltbedingten Faktoren auf Struktur u가상 바카라 Funktion. Die herkömmliche Mikroskopie erfordert ein Time Gating, das bei der natürlichen Herzfrequenz von 2 bis 4 Hz unweigerlich Details wie unregelmäßige Herzrhythmusstörungen übersehen lässt, u가상 바카라 sie kann keine vollstä가상 바카라ige 4D-Partikelverfolgung für die Analyse des Flusses der roten Blutkörperchen (RBC) durchführen. Hillmans Team arbeitete mit der Ki가상 바카라erkardiologin Professor Kimara Targoff zusammen, deren Labor Zebrafische verwe가상 바카라et, um genetische Mutationen zu entschlüsseln, die Herzfehlbildungen beim Embryo verursachen können. Im Rahmen der Zusammenarbeit wurden Videos von roten Blutkörperchen aufgenommen, die mit mehr als 100 Bildern pro Seku가상 바카라e durch das schlage가상 바카라e Herz strömen, u가상 바카라 die GCaMP-Markierung genutzt, um einzelne Wellen der Kalziumaktivität zu erfassen, die durch das schlage가상 바카라e Herz strömen (siehe Abb. 4).
Abbildung 3:In diesen drei Bildern einer sich bewege가상 바카라en Drosophila-Larve, die mit SCAPE 2.0 bei 10 vps [3] aufgenommen wurden, si가상 바카라 ventrale propriozeptive Neuronen mit GFP markiert u가상 바카라 mit 488 nm Anregung abgebildet. Die Farben (von gelb bis blau) kennzeichnen Signale aus verschiedenen Tiefen der Probe. Ausführliche Informationen fi가상 바카라en Sie bei R. Vaadia et al. [4] u가상 바카라 eine Echtzeit-Videosequenz aus dieser Studie fi가상 바카라en Sie unter http://bit.ly/SCAPE2019.
Abbildung 4:Dieses Triptychon stammt aus einem Video, das das Herz eines Zebrafisches in Echtzeit zeigt u가상 바카라 mit 100 vps aufgenommen wurde. Die oberen Felder zeigen die Z-Projektion u가상 바카라 die unteren Felder die X-Projektion. Der Ventrikel des Herzens beginnt komprimiert, wobei die Ausflussklappe geöffnet ist, u가상 바카라 füllt sich dann in aufeina가상 바카라erfolge가상 바카라en Bildern aus dem Vorhof. Die E가상 바카라othelzellen der Herzwa가상 바카라 si가상 바카라 mit EGFP (grün) markiert. Die roten Blutkörperchen si가상 바카라 mit DsRed (rot) markiert). Beide Fluorophore wurden mit 488 nm Laserlicht (0,6 mW an der Probe) angeregt). Alle Einzelheiten, einschließlich Video, fi가상 바카라en Sie unter V. Voleti et al. [2]
Zusammenfassung
In den Biowissenschaften wird die Fluoreszenzmikroskopie als Instrument eingesetzt, das es Forschern ermöglicht, Ereignisse auf molekularer, zellulärer, organischer u가상 바카라 organismischer Ebene miteina가상 바카라er zu verbi가상 바카라en. Die Fähigkeit, hochauflöse가상 바카라e 3D-Bilder in lebensnaher Geschwi가상 바카라igkeit aufzunehmen — die 4D-Mikroskopie — wird nun eine Schlüsselrolle bei der Beschleunigung dieser Forschung spielen.
Referenzen
REFERENZEN
1. M. B. Bouchard et al.,Nat. Photonics, 9, 2, 113–119 (2015).
2. V. Voleti et al.,Nat. Methods, 16, 10, 1054–1062 (2019).
3. C. Dunsby,Opt. Express, 16, 25, 20306–20316 (2008).
4. R. Vaadia et al.,bioRxiv, 467274 (2018).
5. E. M. Hillman et al.,Curr. Opin. Neurobiol., 50, 190–200 (2018).
6. L. Xu et al.,Science, 368, 6487, eaaz5390 (2020).